(1935-2004)
Foto gentileza Revista Pensar
Enlace al resumen de los hechos en "Pensar",
con motivo del fallecimiento del controvertido investigador francés
Por vez primera el artículo ve la luz en la web a través de éste post. Al final del mismo, se ofrecen diez minutos del documental de Horizon que explican la refutación de Maddox, Randi y Stewart, gracias a http://www.youtube.com/user/skizocangi
RECUERDOS DEL AGUA
El caso Benveniste
por Fernando Saraví
Cátedra de Biofísica, facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo, Mendoza, República Argentina
En 1988, la comunidad científica internacional fue sorprendida por un artículo publicado en la prestigiosa revista multidisciplinaria NATURE . En él se informaba que disoluciones de inmunoglobulinas diluidas hasta el punto de no contener moléculas de dichos anticuerpos, eran sin embargo capaces de producir un efecto biológico característico de ellos. De haber sido ciertos, estos resultados hubiesen hecho tambalear los cimientos de las ciencias naturales, y supuestamente hubieran dado apoyo a las creencias homeopáticas. Sin embargo, parece claro que se trató de un fraude o de un error.
El artículo estaba firmado por un grupo internacional de investigadores dirigidos por el doctor Jacques Benveniste, profesor de
El sistema en estudio
Los basófilos son una clase de glóbulos blancos, de los denominados polimorfonucleares, que poseen gránulos que se tiñen de azul violeta oscuro con la tinción de Wright. Los basófilos circulan en la sangre en muy escasa proporción: en el adulto normal, hay entre 20 y 50 basófilos por milímetro cúbico, lo que representa menos del 1% de todos los leucocitos. (2)
Otras células que posiblemente comparten un precursor común con los basófilos y poseen gránulos semejantes, son los mastocitos. Se encuentran en los tejidos, asociados a las mucosas y al tejido conectivo. Los gránulos de basófilos y mastocitos contienen sustancias químicas, como la histamina, cuya liberación es responsable en parte de las manifestaciones de la alergia. (3)
Los basófilos y los mastocitos comparten otra característica común, que es la de poseer en su membrana celular moléculas receptoras capaces de ligar inmunoglobulina E. La inmunoglobulina E (IgE) es el tipo de anticuerpo responsable de las reacciones alérgicas como urticaria, eczema, asma y anafilaxia. Es producida en ciertos linfocitos de sujetos predispuestos, en respuesta al ingreso de sustancias extrañas al organismo.En el plasma sanguíneo normal se encuentra en concentraciones muy bajas (menor de una cienmilésima del total de inmunoglobulinas). El resto de
Cuando ingresa al organismo un antígeno contra el cual el sujeto ha producidoIgE, se liga con
La reacción de desgranulación mediada por
Cada molécula de anti-IgE puede ligarse a dos moléculas de IgE unidas a sendos receptores sobre la superficie del basófilo o mastocito, y dicha unión inicia la reacción de desgranulación.
La piedra del escándalo
El grupo de Benveniste investigaba, en basófilos provenientes de voluntarios normales, la reacción de desgranulación producida por anti- IgE de carnero. La sangre obtenida era centrifugada, obteniéndose plasma rico en glóbulos blancos. Diez microlitros (l) de esta suspensión se mezclaban con
B.Control-B. Muestra x 100
B. Control
Con B. Control= Basófilos en el Control
B. Muestra= Basófilos en
Se empleó una preparación comercial de anti- IgE, cuya concentración era de 1mg/ml, correspondiente a 6,7 x 10 -6 mol/litro (M). El anticuerpo era diluído por agregado de una disolución estándar antes del ensayo. Con la concentración inicial de anti- IgE en el ensayo, de 2,2 x 10 –
Las diluciones seriadas se realizaban tomando un décimo de la dilución inicial y añadiéndole nueve partes de la disolución estándar (1/10), o bien noventa y nueve partes (1/100). El proceso se repetía tantas veces como fuera necesario, hasta llegar a disoluciones de 10 60 y 10 120 , respectivamente. Aún con la disolución de anti Ig-E así diluída, seguían observándose desgranulaciones estadísticamente significativas, de entre 40 y 60 % . El efecto se confirmó mediante observaciones “a ciegas”, en las cuales el que evaluaba la desgranulación no sabía a qué tratamiento había sido sometida cada muestra.
Con diversos procedimientos de separación, los autores determinaron que las altas diluciones carecían de moléculas anti-IgE; empero, conservaban su capacidad de inducir desgranulación. “Así-decían-no hay duda de que hubo degranulación de basófilos en ausencia de toda molécula detectable de anti- IgE”.
Curiosamente, el efecto no se observaba con todas las diluciones, sino que, con sucesivas diluciones se observaban “picos” de desgranulación. Por ejemplo, el efecto podía ser nulo con 1011, de 50 % con 1015, nuevamente nulo con 1017 , de 40% con 1020,etc.
Otro hallazgo extraordinario fue que el efecto de las diluciones extremas solamente se observaba si entre dilución y dilución se efectuaba una vigorosísima agitación mecánica durante no menos de 10 segundos (aunque tiempos de 30 o 60 segundos no aumentaban el efecto). El congelamiento, el calentamiento, y el ultrasonido hacían desaparecer la actividad biológica de las diluciones.
Como hipótesis ante tan curiosos resultados, los autores sugirieron que, dado que no había moléculas de anti- IgE en las diluciones extremas, pero éstas conservaban su actividad biológica, “la información específica (perteneciente a la anti- IgE) debe de haber sido transmitida durante el proceso de dilución y sucusión. El agua podría actuar como una “plantilla” para la molécula, por ejemplo por una red infinita de enlaces de hidrógeno, o por campos eléctricos y magnéticos” (5).
Leyes químicas
La presunta actividad biológica de las diluciones extremas no tenía fundamento en los hechos conocidos de la física y la química. A fines del siglo XVIII, el genial Antoine Laurent de Lavoisier (1743-1794) había sentado las bases de la química moderna. Por la misma época que Samuel F.C. Hahnemann (1755-1843) proponía su sistema homeopático, John Dalton (1766-1844) y Joseph Louis Proust (1754-1826) formulaban las leyes de la estequiometría, que establecen las relaciones posibles entre las masas reaccionantes de diferentes sustancias. Más tarde, los químicos noruegos Guldberg y Waage establecieron que la velocidad a la que se produce una reacción química es proporcional a la “masa activa” de las sustancias reaccionantes; la “masa activa” se representa por la concentración molar. Así, la velocidad con que se produce una reacción dada depende del producto de las concentraciones molares de los reactivos, multiplicado por una constante que depende de la afinidad química de éstos.
Los resultados de Benveniste contradecían todas las leyes mencionadas. Peor aún, suponían que una reacción podía producirse en la completa ausencia de uno de los reaccionantes, según lo predecían sencillos cálculos basados en el número de Avogadro.
El número de Avogadro
Otro contemporáneo de Hahnemann, el científico italiano Amadeo Avogadro (1776-1856) había formulado la hipótesis de que iguales volúmenes de diferentes gases, en idénticas condiciones de presión y temperatura , contenían igual número de moléculas. Más tarde la hipótesis se confirmó y se amplió para los sólidos y los líquidos. Hoy se sabe que una molécula gramo (mol) de cualquier sustancia tiene precisamente 6,022045 x 10 23 moléculas; a ésa cifra se la denomina número de Avogadro. Aquí emplearemos el valor redondeado de 6,02 x 10 23 (602000 trillones). El número de Avogadro implica que existe un número finito de moléculas en un mol de sustancia, y limita el grado de dilución que puede alcanzarse manteniendo aún moléculas de soluto en la disolución.
Benveniste empleó una preparación de inmunoglobulina G anti- IgE que contenía 1 gramo/litro. Dado que el peso molecular de la inmunoglobulina G es de 150000, la correspondiente concentración molar era de 1/150000=6,67x10-
La referida cifra se reducía progresivamente con las diluciones. En una dilución 1010 , por ejemplo, quedarían 1338 moléculas en el ensayo. Para una dilución 10 13 quedaría teóricamente 1,338 moléculas en el ensayo, y para diluciones superiores (de 10 14 y mayores) era improbable que quedase siquiera una molécula.
¿Curva dosis-respuesta?
Cuando lo que se mide como resultado es un efecto biológico (en nuestro caso, la desgranulación), normalmente es posible establecer una relación entre la dosis de una sustancia activa y el efecto biológico observado; su expresión gráfica es una curva dosis-respuesta.
En ensayos in vitro , suele emplearse la relación entre la concentración de la sustancia activa y la respuesta observada. Es común expresar ésta última como porcentaje de la respuesta máxima en relación con el logaritmo decimal de la concentración. En el caso más sencillo, la curva resultante tiene la forma de una “S” itálica. En sistemas más complejos, la forma de la curva varía aunque normalmente puede establecerse algún tipo de correlación matemática entre las dosis (concentración) y la respuesta. (6).
Los resultados de Benveniste no permitían elaborar tal tipo de correlación, ya que se podían obtener resultados similares con concentraciones muy diferentes, y resultados nulos con concentraciones intermedias.
Tampoco ésta observación tenía antecedentes comprobados en biología. Además, en el artículo original se afirmaba, sin datos cuantitativos, que los autores habían obtenido respuesta de desgranulación con altas diluciones de otras sustancias activas, como antígenos específicos capaces de ligar IgE, la enzima fosfolipasa A, y ionóforos (sustancias que facilitan el pasaje de iones a través de las membranas).
Un poco de historia
¿Por qué razón, dado lo increíble estas observaciones, la revista Nature decidió publicarlas? Los antecedentes de la publicación pueden ayudarnos a entender mejor la decisión.
El autor principal, Jacques Benveniste, no era un desconocido en el mundo científico. Este profesor universitario e investigador de carrera era autor de docenas de trabajos científicos publicados en revistas con comité editorial. Algunos de sus trabajos previos habían sido notoriamente influyentes; trece de ellos habían sido citados más de cien veces; un artículo suyo de 1972 tenía en 1988 más de 640 citas y otro de 1979, más de 300. (7). En otras palabras, se trataba de un científico de sólidos antecedentes y excelente reputación. Por lo expuesto, el editor de la revista Nature se vio en un apuro al recibir un informe tan inusual. Las revistas científicas poseen revisores, especialistas en diversas ramas del conocimiento, que evalúan los trabajos científicos que se envían para publicación. Los revisores pueden aconsejar la aceptación o el rechazo de un trabajo, o bien (en la mayoría de los casos) sugerir al autor correcciones o precisiones. (8)
De haber provenido de otra persona, es posible que el informe hubiera sido rechazado sin más. (9). En cambio, se sugirieron numerosas mejoras. La última de ellas fue la confirmación de los resultados por otros laboratorios. Benveniste obtuvo entonces la colaboración de los investigadores israelitas, italianos y canadienses, que figuran como co-autores en el trabajo publicado.
Luego de dos años de interminables revisiones , y ante la insistencia de Benveniste, que ya había adelantado a la prensa francesa algunos de los resultados y creado así grandes expectativas entre el público , el editor de Nature, John Maddox, aceptó el artículo para su publicación, con la condición expresa de que Benveniste autorizase a “investigadores independientes” a observar repeticiones de los experimentos. Así se informó en una “Reserva editorial” al final del artículo.
En el mismo número de la revista, del 30 de junio de 1988, un editorial anónimo titulado “Cuando creer lo increíble” intentaba explicar la posición del editor, advirtiendo que las observaciones inexplicadas “no son siempre un signo de lo sobrenatural”, que Benveniste estaba tan perplejo como el que más por el fenómeno, y que no había ninguna justificación aún para el empleo de las observaciones para “propósitos malignos” (como la defensa de la homeopatía) (10) .
Es mi impresión que este desafortunado editorial resultó una patética disculpa, y en efecto contribuyó más a caldear los ánimos que a tranquilizarlos.
Llegan los cazafantasmas
Según lo prometido, el 4 de julio un grupo de observadores se presentó en Clamart, en las afueras de París, donde se ubica el Laboratorio de Inmunopatología y Alergia dirigido por Benveniste, para observar repeticiones de los experimentos de “alta dilución”. El singular grupo estaba integrado por James Randi, conocido prestidigitador y experto en fraudes en el terreno paranormal, Walter W. Stewart, químico de los Institutos nacionales de salud de EEUU., especializado en fraudes en ciencia, y el editor John Maddox, periodista profesional con conocimientos de física.
Durante la semana de su visita, Randi, Stewart y Maddox observaron la realización de siete experimentos. Los tres primeros se realizaron según la técnica usual en el laboratorio, mientras que los cuatro últimos se realizaron, por exigencia de los observadores “a ciegas” (colocando según un código preestablecido, las diluciones en un orden aleatorio desconocido por quien contaba las desgranulaciones).
Los tres primeros experimentos dieron resultados similares a los informados en el trabajo original, aunque la posición de los “picos”de desgranulación no era reproducible (los picos se producían con diferentes diluciones cada vez). El mismo hecho se reiteraba en los resultados registrados en los cuadernos de protocolo del laboratorio. Además, se notó que, al igual que en el trabajo original, los errores de conteo, que siempre existen, eran mucho menores que lo esperado.
En el cuarto experimento, donde quienes leían- las doctoras Davenas y Beauvois- no sabían que resultado debían esperar, se observaron picos de desgranulación que mantenían la misma altura (cerca de 70%) entre la dilución inicial y la dilución 10 00 Este resultado era poco común, y hubiese tendido a apoyar los datos del artículo. Sin embargo, en este cuidadoso experimento sí aparecieron los previsibles errores de conteo, lo que hizo más sospechosa la ausencia de ellos en los experimentos previos.
Otros tres experimentos “a ciegas” dieron resultados uniformemente negativos: se produjo desgranulación con las concentraciones usuales de anti- IgE, pero no con las “altas diluciones”.
Más datos sugestivos
Además de los resultados de los experimentos, Randi, Maddox y Stewart hicieron diversas comprobaciones bastante comprometedoras.
Primero, los experimentos no siempre “funcionaban”. A veces transcurrían meses sin que se obtuviesen resultados positivos con las “altas diluciones”. La razón de este hecho no había sido investigada sistemáticamente por los responsables.
Segundo, no había un control sistemático del origen de la sangre empleada (sólo se solicitaba que no proviniese de alérgicos). Los basófilos de algunas muestras no mostraban desgranulación en absoluto.
Tercero, los mejores resultados eran obtenidos por la doctora Elisabeth Davenas, quien regularmente contaba más células que sus colegas, y por la doctora Beauvais.
Cuarto, cuando en las muestras tratadas el conteo de basófilos era mayor que en los controles, éstos se recontaban (lo que implica que el conteo no se hacía verdaderamente “a ciegas”). Había registros de experimentos exitosos con diluciones, preparaciones y recuentos hechas por la misma persona, lo cual descartaba totalmente un procedimiento “a ciegas”.
Quinto, existía una larga lista de excusas para descartar los experimentos que “no funcionaban”, sin registrarlos en los cuadernos de protocolo. Dichas razones eran invocadas a posteriori, ante resultados negativos.
Sexto, los controles realizados con inmunoglobulina G anti-IgG, que aparecen en la figura 1b del trabajo original, no se habían hecho al mismo tiempo que el resto de los experimentos.
Séptimo, aunque según el trabajo original, la observación de los basófilos era un método de detectar la desgranulación que se correlacionaba bien con otros métodos, en el laboratorio de Benveniste no habían podido demostrar efecto alguno de las “altas diluciones” midiendo la liberación de la histamina, que es un método más sencillo y seguro que el conteo al microscopio.
Octavo, los salarios de dos de los coautores del artículo que trabajaban en Clamart, eran pagados por la compañía farmacéutica Boiron, accionista mayoritaria de los Laboratorios homeopáticos de Francia. En contra de la práctica normal, el subsidio de Boiron no se menciona en el trabajo original.
Veredicto y apelación
Las observaciones de Nature convinieron con el Dr. Benveniste en que el informe de la investigación se publicaría el 28 de julio, a menos que Benveniste se retractase del artículo, o al menos diese mayores explicaciones y moderase sus conclusiones. Como ello no ocurrió, Maddox, Randi y Stewart dieron a conocer su evaluación. En ella reconocían la diligente colaboración de Benveniste y todo su personal, pero cuestionaban duramente la validez y el significado de los resultados publicados un mes antes. El informe se iniciaba con las siguientes declaraciones:
“Las notables afirmaciones hechas en Nature 8333,816;1988) por el Dr. Jacques Benveniste y sus asociados, se basan mayoritariamente en una serie de experimentos que están mal controlados estadísticamente, en los cuales no se ha realizado un esfuerzo sustancial para excluir el error sistemático, incluyendo el prejuicio del observador, y cuya interpretación es dificultada por la exclusión de mediciones en conflicto con la pretensión de que la anti-IgE en “alta dilución” desgranularía los basófilos. El fenómeno descripto no es reproducible en el significado ordinario del término.
Concluímos que no hay base sustancial para la afirmación de que la anti- IgE en alta dilución (por factores tan altos como 10 120 ) retenga su efectividad biológica, y que la hipótesis de que el agua puede ser marcada con la memoria de solutos pasados es tan innecesaria como fantasiosa” (11).
En la página que seguía a éste informe, apareció una furibunda réplica de Benveniste, quien entre otras cosas, criticaba al grupo de observadores llamándoles “autodesignados guardianes de la conciencia científica”, “aficionados”, “incompetentes”, etc. Les acusaba de crear un” tornado de intensa y constante sospecha, temor y presión psicológica e intelectual, inadecuado para el trabajo científico”, de ser incapaces de comprender el sistema en estudio, y de pretender descartar cinco años de investigaciones sobre la base de una serie experimental.
Criticaba la falta de un plan de trabajo previamente acordado, los procedimientos e incluso la interpretación de los resultados, afirmando que las pruebas realizadas en realidad confirmaban su trabajo en lugar de desacreditarlo.
Aducía que el patrocinio de determinada empresa, según contrato aprobado por el INSERM, no era objeción válida contra los resultados, ya que la investigación realizada por empresas comerciales podía ser excelente y de hecho había logrado varios premios Nobel. Y sobre todo, Benveniste se quejaba amargamente de la actitud de la revista, de publicar su trabajo y desacreditarlo públicamente días más tarde mediante un “todopoderoso escuadrón antifraude y hetedoroxia”. Concluía afirmando que las cacerías de brujas y las persecuciones macchartistas matarían a la ciencia, y exhortando a sus colegas a no permitir que esto ocurriera:
“Nunca, pero nunca, deje que algo como esto ocurra, nunca permita que esta gente se meta en su laboratorio. La única forma de establecer definitivamente resultados conflictivos es repetirlos. Puede ser que todos nosotros estemos equivocados de buena fe. Esto no constituye un crimen, sino que es normal en ciencia, y sólo el futuro sabe (quien tiene razón) (12).
Reacciones diversas
Desde luego, tanto el artículo original como su refutación despertaron una intensa reacción, tanto en la comunidad científica como en el público general. Algunos descartaban el artículo como charlatanismo homeopático, otros lo defendían precisamente como evidencia a favor de la homeopatía. Algunos ofrecieron explicaciones alternativas, y aún otros intentaron verificar los resultados en sistemas afines. Finalmente, hubo una manifestación de apoyo hacia el proceder de la revista, pero muchas más críticas sobre éste particular.
Explicaciones convencionales
En el mismo número de Nature en que se publicó el informe de Maddox, Randi y Stewart, dos científicos belgas sugerían que los “picos” de desgranulación observados podían deberse a contaminación de depósitos contiguos en las placas de microtitulación (13). Dichas placas, en efecto, tienen 96 depósitos para muestras, y era posible que durante su llenado secuencial se contaminasen no solamente depósitos contiguos de una misma fila, sino también depósitos de filas adyacentes, que corresponderían a diluciones muy diferentes, por lo que aún un pequeño grado de contaminación con anti –IgE podría ser significativo.
El Dr. Danchin, del Instituto Pasteur de París, sugería que el anticuerpo podía interactuar con las paredes de los tubos de ensayo durante la sucusión, generando algún compuesto activo (14). Más tarde se propuso que la agitación vigorosa, capaz de generar enormes variaciones localizadas de presión y temperatura, podía originar especies químicas altamente reactivas, e indicaba formas de poner a prueba esta hipótesis (15).
También se sugirió que el efecto observado podía deberse a alguno de los solutos presentes en la disolución empleada para diluir la anti- IgE, dando fragmentos pequeños (y por ende difícilmente detectables) pero capaces de ligarse a
Finalmente, el Dr. Farouk Shakib, del Centro de Tratamiento e Investigación del Asma y
Debe notarse que ninguna de las hipótesis propuestas explicaba satisfactoriamente los datos. Por ejemplo, la hipótesis de contaminación de las placas podía explicar la existencia de “picos” de desgranulación, pero no la necesidad de agitación vigorosa. La hipótesis de los anticuerpos podía explicar los resultados con altas diluciones y el hecho de que los resultados no siempre se observasen, pero no la existencia de “picos” ni la necesidad de agitación vigorosa. Por otra parte, el resto de las hipótesis podía explicar la necesidad de agitar vigorosamente y el efecto de las altas diluciones, pero no la falta de reproductibilidad, ni la existencia de “picos”.
Intentos de convalidación
Diversos inmunólogos intentaron reproducir el efecto de las “altas diluciones” en sistemas biológicos semejante. Metzger y Dreskin, de los institutos nacionales de salud de EEUU, utilizaron la liberación de la amina biógena serotonina, marcada como tritio, para detectar la desgranulación de una línea cultivada de mastocitos de rata, sensibilizados con IgE. Emplearon tanto el antígeno específico de la referida IgE, como una anti-IgE. En ambos casos se observó liberación de serotonina con las concentraciones usuales, pero no con las “altas diluciones “preparadas según lo preconizado por Benveniste (19). Otro intento independiente de replicación en un sistema similar al de Metzger y Dreskin fue igualmente negativo (2).
Bonini, Adriani y Balsano, de
En resumen, los intentos de convalidación fueron uniformemente negativos, lo que tornó mas graves las dudas sobre los resultados y conclusiones de Benveniste y colaboradores.
Adhesiones
No faltaron quienes defendiesen el artículo de Benveniste. Mark Johnson, del Instituto tecnológico de Massachussets, al tiempo que se declaraba escéptico sobre las afirmaciones del trabajo, consideraba que había sido adecuadamente realizado, y que la ciencia tenía recursos para investigar si había habido error en los resultados o su interpretación (22). El Dr. Taylor Reilly, de
“Sembrar dudas sobre hallazgos meramente porque ellos son inconvenientes para suposiciones y modelos de especulación establecidos me impacta como una pobre forma de hacer avanzar a la ciencia” (24).
Los homeópatas Robin y Sheila Gibson afirmaban que la idea de que los resultados de Benveniste refutasen las leyes químicas era ilógica, y que las “altas diluciones” no eran esenciales para la homeopatía, ni tampoco constituyesen la base de ésta. Sugerían que los avances en la física cuántica (¡) podrían resolver la controversia (25). ¡En el número del 20 de octubre, un corresponsal sugería que James Randi podría haber empleado prestidigitación para sabotear los experimentos durante su visita a Clamart! (26).
Repudios
Ronald H. Plasterk, del Instituto del Cáncer holandés, hizo notar que el artículo de Benveniste tenía las características típicas de las afirmaciones homeopáticas: insuficiente descripción de los materiales y métodos, indicios sugestivos, y audaces afirmaciones sin datos confirmatorios. Luego hacía notar que:
Éste resultará otro caso más de artefactos (o algo peor), pero el daño ya está hecho; el reconocimiento mundial de este importante paradigma de la homeopatía por una importante revista científica. La industria homeopática… no se preocupará por una breve retractación en Nature (que tendrá mucho menor atención de la prensa que las afirmaciones originales). (27)
En la misma vena, Lipowicz insistía en que dado el dogma homeopático, sería muy difícil convencer a los homeópatas de que los resultados de Benveniste no eran reales: mientras que la ciencia acepta el veredicto de la reproducibilidad, la homeopatía buscaría explicaciones para ignorar la evidencia en contra (28).
Otro autor sugirió que toda la controversia se debía simplemente a la ignorancia de los principios químicos elementales (29). W. Fierz, de
Un poco de buen humor
Una carta a Nature decía que el trabajo de Benveniste permitía explicar como James Bond podía distinguir entre un Martini batido y uno revuelto (32). Otro decía que se había confirmado su sospecha de que los trabajos enviados a Nature eran evaluados por el editor, un mago y su conejo (33). La revista médica The Lancet publicó dos breves noticias muy jocosas (34) Pero la palma cómica se la llevó el siguiente argumento por el absurdo:
“Para obtener una cura para todas las enfermedades sensibles a terapia química, uno sólo necesita beber agua desionizada de alta pureza, ya que todas las sustancias químicas están presentes en esta agua pura, en dilución infinita” (35).
Lo mismo fue planteado por la revista francesa Science et Vie , que se preguntaba cómo podía existir agua pura, en caso de que esta sustancia poseyese “memoria”.
A río revuelto…
Mientras la controversia científica continuaba, muchas publicaciones populares recibían los resultados de Benveniste como la sanción científica de la homeopatía. Si bien algunos periódicos franceses adoptaron una postura circunspecta, otros, como Le Monde, se lanzaron decididamente a la defensa de Benveniste. Entre tanto, los laboratorios homeopáticos aumentaron su caudal de ventas, y a la empresa Boiron, que subsidiaba las investigaciones de Clamart, adquirió el resto del paquete accionario de los Laboratorios Homeopáticos de Francia (36).
Críticas a Nature
Uno de los primeros árbitros designados por Nature para evaluar el trabajo de Benveniste, consideró que el artículo no debió publicarse sin previa repetición de los experimentos en laboratorios seleccionados por el editor (y no por Benveniste). Además consideraba que el informe producido por Maddox, Randi y Stewart había contribuído a la atmósfera circense engendrada por el artículo original (37). Otros autores hicieron críticas parecidas (38). Arnold Relman, editor del prestigioso New England Jounal of Medicine, opinó que Nature debería haber aceptado o rechazado el trabajo, pero no efectuar por sí misma la investigación, tarea ajena a la revista como tal (39). Según Eugene Garfield, director del Instituto para
“Por qué el equipo de observadores no incluyó un inmunólogo es desconcertante. En términos más amplios, es aún más lamentable que la revista tomase sobre sí éste papel de jurado después de publicar el artículo. ¿Por qué no antes?... Pudiera ser que la “historia” (en sentido periodístico) era demasiado buena-una garantía para causar tentación y atraer publicidad para Nature?... Si así es, resulta verdaderamente desalentador que una por otra parte sobresaliente revista de ciencia ponga a sus propios intereses por encima de los de la comunidad a la que sirve “ (40).
Gregory Petsko, del Departamento de Química del Instituto Tecnológico de Massachussets, hizo notar con fundamento cuan grotesca había sido la investigación de Maddox, al tomar precauciones (como adherir el sobre con los códigos de los ensayos a ciegas al techo del laboratorio) que se explican sólo si se esperaba un fraude deliberado, que es algo muy diferente que detectar errores. También criticaba la actitud de Benveniste, con su pose de sabio perseguido. La atmósfera así creada, decía, polariza las discusiones, crea un clima más emocional que racional para una investigación, y deja al público con la impresión de que la ciencia es una institución monolítica, hostil hacia nuevas ideas e implacable en su defensa de las ya establecidas. (41).
El propio Maddox confesó que la inclusión de Randi se debió efectivamente a que sospechaba fraude, aunque de hecho no se pudo comprobar tal cosa. Aunque según Benveniste, Stewart había afirmado, durante su visita a Clamart, que los resultados estaban “dibujados”, en una entrevista para revista Omni el experto en fraudes se quejó más bien por la omisión de datos cruciales en el trabajo original, y sugirió que la predisposición de la doctora davenas para obtener resultados podía ser la causa de las observaciones (42). Randi opinaba de manera parecida, agregando que a su juicio Benveniste estaba sinceramente convencido de la realidad de los hallazgos informados (43).
Respuestas de Maddox
El editor de Nature defendió su posición en un editorial titulado “Cuando publicar pseudociencia”. Allí se argüía sin demasiada convicción que:
“La opinión de que esta revista no debió haber publicado un famoso artículo sobre disoluciones libres de soluto pasa por alto la función multivalente de una revista general de ciencia.
Natural, pero equivocadamente, un puñado de lectores…están perplejos porque nature haya publicado el artículo por el Dr. Jacques Benveniste y sus asociados… Las revistas generales como ésta son aquejadas de un torrente de literatura posiblemente heterodoxa…Pero es raro que tal cosa provenga de un laboratorio apoyado por el gobierno, que su autor principal insista en la publicación en contra del sentido común, y se queje de que la falta de publicación equivaldría a la supresión de la verdad… Además, no hay reglas absolutas de que revistas como ésta, que se enorgullecen en publicar una gran cantidad de ciencia original, no pueda en ocasiones dar a conocer un material de naturaleza diferente. De hecho, la publicación de ciencia espuria puede, en ocasiones, ser un servicio público…
…¿quién puede pretender, en fin, que la ciencia excelente sea toda la ciencia? (44).
La mejor respuesta sintética a ésta débil defensa fue dada por el editor de la otra principal revista multidisciplinaria, Science, Daniel E Koshland, Jr, quien hizo notar que el papel de una revista multidisciplinariaera el de “alentar la herejía, pero desalentar la fantasía” (45).
Además, la revista había anunciado una investigación en Clamart a ser efectuada por “observadores independientes”. Es obvio que el editor de la propia revista, juez y parte, no encajaba en absoluto en esa descripción. El mismo título y tono general del informe (“High dilution” experiments a delusion) también expuso a Maddox a justas críticas. (46).En inglés, la palabra delusion es ambigua, pudiendo referirse a una ilusión o a un engaño deliberado.
La ausencia, ya subrayada, de un especialista en inmunología experimental entre los observadores, es otro grave e inexcusable error. En un resumen destinado a poner punto final a la controversia, Maddox llegó a decir que “si un grupo de aficionados pudieron tan rápidamente descubrir errores de procedimiento de tanta importancia, esto es suficiente justificación” (47). Sin embargo, esto es algo que no podía saberse de antemano. Además, el grupo no descubrió fehacientemente la causa de los resultados.
Peor aún, en el citado resumen, Maddox puso de manifiesto una y otra vez su falta de dominio en el tema.
Primero, decía que los basófilos son una “subclase de linfocitos” (p. 760), cuando es bien sabido que pertenecen a una diferente estirpe celular que los linfocitos (48).
Segundo, calculaba mal la concentración de anti- IgE en el preparado comercial, dando la cifra de 2,2x10-
Tercero, presentaba en la figura 1, el resultado de uno de los experimentos observados en Clamart como “típico”, cuando en el informe anterior había llamado la atención del mismo experimento como atípico , e incluso citando palabras de Benveniste en el mismo sentido (“ No hemos visto uno como éste antes”) (49). Más abajo, sin embargo, ¡reiteraba lo dicho por benveniste! (p.762).
Cuarto, continuaba aceptando la afirmación de Benveniste de que la desgranulación no se correlacionaba con la liberación de histamina, sin presentar resultado alguno al respecto (p. 761).
Quinto, justificaba la presencia de Stewart por haber sido uno de los principales árbitros del artículo de Benveniste. Esto mas bien hablaba en contra de la elección, por cuanto Stewart había pasado por alto obvias anomalías en las estadísticas, que ya mencionamos.
Sexto, afirmaba que todos los árbitros habían sido excelentes. Esto implica que quien se equivocó fue el mismo Maddox, pues la responsabilidad final de la publicación era de él.
A pesar de todo esto, Maddox continuaba justificando su proceder en una airada protesta a la revista Science (50).
Respuestas de Benveniste
El Dr. Benveniste hizo aún peor papel que Maddox. Si bien su alegato final en Nature señalaba con razón aspectos cuestionables de la investigación de Maddox, randi y Stewart, su arrogancia le traicionaba al rechazar todos los intentos de replicación, con la excusa de que no habían empleado exactamente el mismo método que él, y al afirmar (contra lo dicho en la introducción de su trabajo) que la liberación de histamina no se correlacionaba bien con la desgranulación evaluada ópticamente (51).
Para peor, tras haber afirmado que su publicación era un pedido de ayuda para explicar esos resultados intrigantes, descartaba sumariamente los intentos de explicación propuestos por otros:
“Varias cartas proponen hipótesis más atrevidas que nuestros datos… Las respuestas a estas divertidas fantasías se hallan en nuestra figura 1b”.
Tras otra encendida protesta, concluía diciendo que “los hechos son tercos, y nosotros también… Hay más por venir”.
Lamentablemente, era precisamente la solidez o “terquedad” de los datos lo que estaba más en duda. Además de no ser fácilmente replicables, y de tener un defectuoso tratamiento estadístico, se habían obtenido en un sistema muy poco confiable.
En efecto, la observación de la desgranulación de los basófilos como una prueba de alergia había sido propuesta décadas atrás, irónicamente en un artículo publicado en Nature (52). La razón por la cual nunca se popularizó fue precisamente su escasa reproducibilidad. Los basófilos son células escasas, por lo que su conteo está sujeto a considerable fluctuación estadística. Además, decidir por microscopía si un basófilo está efectivamente desgranulado no siempre es sencillo.
Dada la naturaleza extraordinaria del presunto hallazgo, era de esperar que se tomasen mayores precauciones en cuanto al diseño experimental, y los resultados obtenidos con el dudoso método fuesen confirmados por otra técnica más confiable y generalmente aceptada. Nada de esto se hizo. Martin Gardner planteó bien el asunto al escribir:
“Considere el egocentrismo y la locura de éste hombre. Se lanzó a la prensa con una afirmación tan extraordinaria que si fuese cierta revolucionaría la física y la medicina, y le garantizaría un premio Nobel. Empero, lo hizo sin preocuparse por aprender las técnicas más elementales para conducir ensayos verdaderabente “doble a ciegas” o para supervisar observadores que se engañaban a sí mismos”. (53)
Es muy probable que , como fundamentó muy bien el Dr. Elie Shneour en Skeptical Inquirer , Benveniste estuviese sinceramente convencido de la validez de sus datos. (54)
Sin embargo, ello sugiere orgullo y terquedad más que objetividad científica.
Los datos, ¿apoyaban la homeopatía?
Retrospectivamente, resulta claro que los resultados de Benveniste, así como la hipótesis propuesta para explicarlos, pretendía dar convalidación científica a las creencias homeopáticas. Benveniste había dado a conocer de antemano sus hallazgos en el Congreso Nacional de Homeopatía, donde anunció que ellos se publicarían en Nature; en el trabajo mismo se vinculaban los resultados con el de un estudio clínico de Reilly y colaboradores, sobre tratamiento homeopático de la rinitis alérgica (55). Finalmente la investigación recibió apoyo de una empresa con fuertes intereses en la industria homeopática (que dicho sea de paso, pagó los gastos de estadía de Maddox, Randi y Stewart).
Sin embargo, un análisis cuidadoso demuestra que el estudio de Benveniste no apoyaba en modo alguno las creencias homeopáticas.
En otra he examinado críticamente los fundamentos de la homeopatía (56). Por tanto, aquí haré sólo una breve referencia a sus principios básicos relacionados con el trabajo de Benveniste, a saber: que lo similar cura a lo similar, las altas diluciones con agitación vigorosa, y la individualización del tratamiento.
Según el primer principio citado, el enfermo debe tratarse con la sustancia que, administrada a una persona sana, reproduce con mayor fidelidad los síntomas de la enfermedad. Según el segundo postulado, la sustancia elegida debe administrarse extremadamente diluída, a veces en tal grado que difícilmente quede siquiera una molécula de sustancia activa en cada dosis.
Se supone que la dilución, acompañada de una vigorosa agitación mecánica, produce en la sustancia un proceso denominado por Hahnemann “dinamización, que le confiere nuevas propiedades, no manifiestas en la sustancia original. En su Organon (párrafo 269, nota 149) Hahnemann dice:
“Diariamente oímos llamar sólo diluciones a las potencias medicinales homeopáticas, que son precisamente lo contrario, es decir, un verdadero descubrimiento que revela y manifiesta el poder medicinal específico oculto en las sustancias naturales, por medio de la fricción y sucución”.
En el arcaico lenguaje de Hahnemann, la trituración y agitación mecánica “espiritualizan” la sustancia dándole un “mágico poder curativo”. Hoy los homeópatas prefieren actualizar estas expresiones, hablando de “energización” que le conferiría a la sustancia nuevas e insospechadas propiedades curativas. Sin embargo, según Benveniste la anti-IgE diluída producía el mismo efecto que el antisuero en concentraciones normales; en otras palabras, no se demostró ninguna nueva propiedad de la anti- IgE diluída. Si el efecto es el mismo, ¿para que diluir?.
En segundo lugar, para apoyar las creencias homeopáticas, hubiese sido preciso demostrar que la anti-IgE tenía, en basófilos de pacientes alérgicos, un efecto opuesto al que causaba en los voluntarios no alérgicos. Nada de esto se documentó. Además, la existencia de “picos” de actividad con ciertas diluciones, y “valles” de inactividad con otras, que variaban entre una y otra serie, haría que el homeópata no pudiese predecir exactamente cual dilución (o “potencia” en la jerga homeopática) será efectiva y cual no lo será (57). La exquisita e impredecible sensibilidad del efecto a las modificaciones del grado de dilución hubiese sido otro contundente mazazo contra la maltrecha homeopatía.
Finalmente, la concepción homeopática de la individualización del tratamiento tampoco se condice con los datos del trabajo de Benveniste. Según las teorías de Hahnemann , el tratamiento debe formularse sobre una base estrictamente individual, conforme a los antecedentes, signos y síntomas de cada paciente en particular.
Si bien es indudable que existe una amplia variabilidad individual, la medicina moderna ha obtenido notables éxitos en el conocimiento de los mecanismos de la enfermedad, su diagnóstico y su tratamiento, sobre la base de clasificar las enfermedades por criterios clínicos y exámenes complementarios. Así, los tratamientos pueden evaluarse estadísticamente, al compararse los resultados obtenidos en grandes números de pacientes que padecen de la misma enfermedad. El buen médico obtiene los mejores resultados aplicando estos criterios generales, sin descuidar por ello los aspectos particulares de cada paciente.
En la homeopatía clásica, el diagnóstico es exclusivamente clínico, y el axioma de que “no hay enfermedades, sino enfermos” es llevado a un extremo irracional.
Debido a esta individualización extrema agravado por el desinterés en los métodos auxiliares de diagnóstico (anatomía patológica, bioquímica, diagnóstico por imágenes, electrocardiografía, etc). La homeopatía carece de base para una nosología o clasificación científica de las enfermedades.
Es precisamente esta circunstancia la que hace difícil o imposible la realización de ensayos terapéuticos controlados, y por lo tanto impide la evaluación experimental de la terapéutica homeopática según las normas internacionalmente aceptadas de la medicina moderna. Como lo expresan Reisser, Weldon y Reisser:
…”la tradición homeopática elimina virtualmente la posibilidad de un estudio científico. Normalmente, una terapia se evalúa por medio de un grupo de pacientes que es tratado, con un grupo similar que no lo es. Las conclusiones obtenidas son rutinariamente escrutadas, a menudo cuestionadas, y a veces revisadas en el foro abierto de las revistas y conferencias científicas. Pero ¿cómo puede ud . comparar grupos “tratados” y “no tratados” cuando la clasificación de las enfermedades carece de significado y cuando no hay dos pacientes que sean tratados exactamente de la misma manera? (58).
Por el contrario, según los datos del estudio de Benveniste, los basófilos de diferentes individuos respondían de manera uniforme a un tratamiento determinado; si los referidos datos se hubieran confirmado, solamente hubieran añadido una evidencia más en contra de la concepción homeopática de la individualización extrema del tratamiento. Debe recordarse que Hahnemann formuló su sistema cuando apenas surgían las bases de la química, y antes del desarrollo de la bioquímica, la anatomía patológica , la genética, la fisiología, la inmunología y la farmacología; por tanto, estas ciencias no tienen cabida en los moldes homeopáticos, consolidados dos siglos atrás.
El golpe de gracia
El escándalo del “agua con memoria” sirvió para desprestigiar a una de las mejores revistas científicas del mundo e, injustificadamente, aumentar la venta de placebos etiquetados como “medicamentos” homeopáticos. La respuesta de los basófilos a la anti IgE en “altas diluciones” nunca se confirmó, ni siquiera por un laboratorio canadiense que participó en un estudio original. Como era previsible, la controversia surgió , llegó a su apogeo entre septiembre y octubre de 1988, y decayó abruptamente en dos o tres meses, por falta de más evidencia sobre la cual debatir. (59).
Sin arredrarse ni siquiera cuando el museo del MIT le otorgó una parodia del premio Nobel reservado a los más destacados charlatanes en ciencia, Benveniste continuó defendiendo su supuesto descubrimiento con un ahínco digno de mejor causa. Sin embargo, parece que el destino finalmente le ha alcanzado: en 1993 el director general del INSERM comunicó la disolución de la unidad 200. Hasta ahora, la vehemente protesta de Benveniste- fiel a su pose de sabio perseguido por su originalidad- no ha modificado la drástica decisión. (60).
Y es difícil que la situación se revierta, porque el golpe de gracia sobre el asunto del “agua con memoria” acaba de ser asestado. Se recordará que Benveniste rechazó la evidencia en contra proveniente de laboratorios que no habían empleado la misma metodología que él. Pues bien, el 9 de diciembre de 1993, Nature publicó un estudio de los Dres. Hirst, Hayes, Burridge, Pearce y Foreman, de los departamentos de farmacología, estadística y química del University College de Londres. Los británicos emplearon el mismo método que Benveniste, con determinación “a ciegas” de la desgranulación de basófilos por recuento directo y un análisis estadístico minuciosos. Concluyeron que no hay “ninguna evidencia de que las diluciones elevadas de anti-IgE…causen ningún efecto reproducible sobre la desgranulación de leucocitos basófilos humanos” (61).
Au revoir, Dr Benveniste!
Aunque es dudoso que Benveniste acepte la derrota, pocos fuera de un grupo de incondicionales pueden abrigar dudas de que la suerte del “agua con memoria” está echada. Como dijo el propio Benveniste, los hechos son tercos…
Este fiasco es una advertencia en contra de aceptar hallazgos supuestamente revolucionarios, antes de que ellos sean confirmados y bien establecidos. Es obvio que la ciencia no avanzaría sin nuevos hallazgos, pero se requiere un sano escepticismo para evaluar con ecuanimidad los datos nuevos y las hipótesis basadas en ellos. El Dr. Benveniste se lamentaba de que se pretendiese descartar el resultado de cinco años de trabajo de su laboratorio. Empero, haber aceptado crédulamente sus hallazgos hubiese implicado arrojar por la borda los conocimientos obtenidos en doscientos años de trabajo, en todos los laboratorios científicos del mundo, y junto con ellos, nuestro juicio crítico y nuestro sentido común. EOE
Notas
(1) E. Davenas & col, Human basophil degranulation triggered by very dilute antiserum against IgE. Nature, 333:816-818, 1988
(2) Stuart C. Finch, en W.J.Williams & col. (Dir), Hematology, ed 2 (Mac Graw-Hill, Nueva York, 1977, p.718, 746)
(3) Véase, v.g., Ivan Roitt & co. (Dir), Immunology, ed 2 (Gower Medical Publishing, Londres, 1989); André Capron & col., Present et future de l’allergie. Medecine/Sciences 6: 958-964,1990; Ricardo A. Margni (Dir), Inmunología e Inmunoquímica, ed. 4 (Panamericana, Buenos Aires, 1989; cap. 19)
(4) Roitt,oc. (n.3), pag. 19.10s. Para un tratamiento en profundidad de la biología molecular de la inmunoglobulina E y sus receptores, véase B.J. Sutton y H.J. Gould, The human IgE network, Nature 366: 421-428, 1993. Esta revisión con 112 referencias ni siquiera menciona el trabajo de Benveniste.
(5) Davenas, o.c. (n.1), p.818
(6) Un excelente tratamiento del tema puede leerse en el Cap. 39 de C.J.Bowman y M.J. Rand, Textbook of Pharmacology, ed.2 (Blackwell, Oxford, 1980). Hay edición en español.
(7) Eugen Garfield, Citation perspective on Jacques Benveniste-Dew process at last? (Current Comments). Current Contents (LS), nº 13, p.3-7, 27/3/1989
(8) Un instructivo y divertido sumario del proceso de evaluación y aceptación de trabajos científicos puede hallarse en el libro de Robert A. Day, How to write and publish a scientific paper (ISI Press, Filadelfia, 1979, p.72-83). Hay edición en español
(9) When to believe the unbelievable (Editorial) Nature 333:787,1988
(10) Ibid.
(11) John Maddox y col., “High dilution” experiments a delusion (News & Views). Nature 334: 287-290, 1988.
(12) Jacques Benveniste, Dr. Jacques Benveniste replies (News & Views). Ibid, p.291.
(13)
(14) A. Danchin, Ibid.
(15) K.S. Suslick, Only the smile is left (Correspondence) . Nature 334: 375s, 1988
(16) J. L. Glick; M. J. Escribano, Ibid.
(17) R. Schilling, More on Benveniste’s “dilution results” (Correspondence) Nature 335: 584, 1988.
(18) F. Shakib, The debate continues (Correspondence). Nature, 335:564, 1988.
(19) H. Metzger y S. Dreskin, Only the smile is left (n.15)
(20) J.C.Seagrave, Evidence of non-reproductibility (Correspondence). Nature, 334: 559, 1988 .
(21) Sergio Bonini y col. , Ibid.
(22) M. Johnson, Outlandish claims (Correspondence). Nature 335: 392, 1988.
(23) D. T. Reilly, Explanation of Benveniste (n.13)
(24) K. Opitz, Ibid.
(25). R.G. Gibson y S. L.M. Gibson Controversy Continues (Correspondence). Nature. 335: 200, 1988.
(26) D. Dunthorn, The debate continues (n .18)
(27) R.H.A Plasterk, Explanation of Benveniste (n.13)
(28) P.J. Lipowicz, Unreproducible results (Correspondence) Nature 335: 109, 1988
(29) L.Lane, Ibid.
(30) W. Fierz, Explanation of Benveniste (n.13)
(31) P. M. Gaylarde, Only the strule is left (n.15)
(32) A. Nisonoff, Explanation of Benveniste (n.13)
(33) K. Snell, Evidence of non reproductibility (n.20)
(34) Amadeo Avogadro meets IgE . Lancet. II (8602): 117, 1988; Delusion in Clamart Ibid (8606): 347
(35) J.P. Shoup, The debate continues (n.18)
(36) Peter Coles, Benveniste Controversy rages on in the French press (New & Nes) Nature 334: 372,1988 .
(37) Metzger y Dreskin, l.c. (n19)
(38) B.H.Bland, Unreproducible results (n.28); G.J. Neville y P. Taylor. Controversy continues (n25); JF.Claire. More on Benveniste’s “dilution results” (n. 17)
(39) Robert Pool, More Squabbling over unbelievable result. Science 241: 658, 1988
(40) Eugene Garfield, Contrary to Nature? (Editorial). The Scientist 2 (16): 12, 5/9/1988
(41) G. A. Petsko, Unreproducible results (n.28)
(42) Doug Stewart, Omni 11 (5): 64-66,87-94, Feb.1989.
(43) Jame Randi, The case of remembering water. Skeptical Inquirer 13: 142-146, Winter 1989
(44) When to publish pseudo-science (Nature) 334: 367, 1988
(45) Citado por James
(46) Por ejemplo, Claire (n.38).
(47) John Maddox, Waves caused by extreme dilution (News & Views). Nature 335:760-763,1988.
(48) Véase , v.g., Oscar Zangheri, en H.E. Cingolani y col. (Dir), Fisiología Humana de Bernardo A. Houssay, ed. 6 (El Ateneo, Buenos Aires, 1988, vol 1, p.II.5-11 y 33-36)
(49) Maddox y col. (n.11), p.288.
(50) J. Maddox, Maddox on the Benveniste affair (Letter). Science 241: 1585s, 1988. Tampoco Benveniste dejó de replicar: Benveniste on Nature investigation, Ibid., p.1028.
(51) Jacques Benveniste, Benveniste on the Benveniste affair (News & Views). Nature 335:759, 1988.
(52) Walter B. Shelley y Lennart Juhlinn, A new test for detecting anaphylactic sensitivity : The basophil reaction. Nature 191: 1056-1058, 1961.
(53) Martin Gardner, Water with memory? The dilution affair. Skeptical Inquirer 13: 132-140, Winter 1989
(54) Elie Shneour, The Benveniste case: A reappraisal. Ibid. 14: 91-95, Fall 1989.
(55) D. T. Reilly y col., Is homeopathy a placebo response? Controlled trial of homeopathic potency, with pollen in hayfever as a model. Lancet II (8512): 881-886, 1986
(56) Fernando D. Saraví, La trampa de las medicinas alternativas (CLIE, Terrassa, 1993; Cap. 9)
(57) Wallace I. Sampson, When not to believe the unbelievable. Skeptical inquirer 14: 90s, Fall 1989.
(58) Paul C. Reisser y col., New Age Medicine: A Christian perspective in holistic health (InterVarsity Press, Downers Grove, 1988, p.140)
(59)
(60) Anónimo, Memoire de l’eau, la bataille reprend. AFIS-Science et Pseudosciences 206: 28-29, Nov-Dec.1993.
(61) S.J. Hirst y col, Human basophil degranulation is not triggered by very dilute antiserum against human IgE. Nature 366: 525-527, 1993.
